銳談 | Nat. Catal：利用電子通道的大腸桿菌代謝工程生產(chǎn)天然產(chǎn)物

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發(fā)布時間：2023-12-14 11:12
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在眾多參與天然產(chǎn)物生物合成途徑的酶中，真核細胞色素P450通常是決定生產(chǎn)效率的關(guān)鍵酶，可以催化脫氫、異構(gòu)化、環(huán)氧化和羥基化等一系列反應(yīng)。然而，真核生物P450s在細菌中的功能表達仍然普遍困難。除真核細胞色素P450的跨膜特性在細菌中并不常見之外，另一重要的問題是膜結(jié)合的P450s和P450s還原酶之間的物理距離會極大影響反應(yīng)效率。因此，在涉及競爭反應(yīng)或有毒中間體的多步生物合成途徑中，通過使用支架蛋白將多種酶固定在鄰近位置來引導(dǎo)底物的策略有助于提高整體反應(yīng)速率并將代謝物快速轉(zhuǎn)化為所需產(chǎn)物。

本文通過使用電子通道策略對E. coli進行代謝工程改造，并結(jié)合底物通道等其他代謝工程手段，實現(xiàn)了葉黃素、(+)-諾卡酮、芹菜素和左旋多巴的高效生產(chǎn)（圖1）。

作者首先構(gòu)建了生產(chǎn)葉黃素的E. coli菌株，在其基礎(chǔ)上采用底物通道策略，利用Photorhabdus luminescens來源的支架蛋白CipA，使其通過形成具有酶活性的蛋白質(zhì)結(jié)晶包涵體（PCI）將番茄紅素ε環(huán)化酶（LUT2）和LCYBmut錨定在一起，從而提高葉黃素產(chǎn)量。

然而，大多數(shù)α-胡蘿卜素沒有轉(zhuǎn)化為葉黃素，表明包含兩個P450s的反應(yīng)步驟是葉黃素生物合成途徑的主要瓶頸。P450位于胞質(zhì)，而其還原酶ATR2在細胞膜上，二者距離過大降低了電子傳遞效率。因此設(shè)計了一種電子通道策略，這次使用發(fā)光桿菌來源的支架蛋白CipB，將trLUT5、trLUT1和ATR2連接在一起，構(gòu)建出LUT5M菌株，能產(chǎn)生5.8 mg/L葉黃素，是之前LUT4M菌株的3.41倍。

血紅素是P450的輔酶，增加其產(chǎn)量可能提高電子傳遞效率。將與血紅素合成有關(guān)的hemAfbr、hemL、hemB 和hemH四個基因以不同組合進行過表達，構(gòu)建了LUT5MH1和LUT5MH2菌株，發(fā)現(xiàn)過表達hemAfbr和 hemL的LUT5MH1菌株能明顯增加P450活性，葉黃素產(chǎn)量上升到10.34 mg/L。最終在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下通過補料分批發(fā)酵產(chǎn)生了218 mg/L葉黃素。

對于 (+)-諾卡酮、芹菜素和左旋多巴三種化合物，作者同樣將電子通道策略運用到P450催化的生物合成步驟中，它們的產(chǎn)量均有不同程度的提高。但區(qū)別在于，在葉黃素的案例中融合CipB和酶（P450和P450還原酶）時不需要連接子，但這三種化合物的融合蛋白之間需要連接子。這種差異可能是由CipB和酶融合引起的幾何變化以及CipB融合時表達水平的變化造成的。

總之，該研究介紹了支架蛋白CipA在底物通道系統(tǒng)和CipB在電子通道系統(tǒng)中的應(yīng)用，通過促進P450與其還原酶之間的電子轉(zhuǎn)移從而提高了天然產(chǎn)物產(chǎn)量，通過增強代謝工程大腸桿菌中葉黃素、諾卡酮、芹菜素和左旋多巴產(chǎn)生證明了該方法的通用性。